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              科研進展

              深圳先進院開發空間連續定向進化系統

              發布時間:2022-09-27 來源:深圳先進技術研究院

              9月21日,中國科學院深圳先進技術研究院劉陳立課題組與傅雄飛課題組合作在Molecular Systems Biology上發表了題為Exploiting spatial dimensions to enable parallelized continuous directed evolution”的文章。該項工作定量研究了細菌-噬菌體在空間上共同生長遷移的動力學過程,并基于這一定量理解,發展了空間噬菌體輔助連續定向進化系統(Spatial Phage-Assisted Continuous Evolution, SPACE),實現了合成生物元件的大規模平行進化。

                

                  深圳先進院合成所劉陳立研究員、傅雄飛研究員為該文章的通訊作者,助理研究員魏婷、賴旺生、博士研究生陳茜、及助理研究員張易為該文章的共同第一作者。 

                

              文章上線截圖 

                文章鏈接https://doi.org/10.15252/msb.202210934 

                  

                合成生物學旨在以工程化的理念改造或創造人工生物系統,以期理解生命、改造生命、合成生命乃至設計生命。生物元件作為合成生物系統基本單元,它的數量和功能制約著合成生物學的發展。傳統手段通過挖掘天然生物系統獲得生物元件,其性能常常不能滿足人們的需求;通過理性設計發展全新生物元件的方式雖有潛力,但目前還受限于設計能力;而通過定向進化,利用進化這個“上帝之手”的力量來對已有元件進行改造和優化獲得所需的功能,已成為合成生物學領域中一項重要的關鍵平臺性技術。 

                傳統的定向進化方法一般分為突變建庫和篩選這兩個步驟[1],循環迭代需要大量的重復操作,耗費人力物力和時間。連續定向進化方法(continuous directed evolution)則利用可自我復制的生物體,在其基因組復制過程引入突變、并利用突變后該生物體復制擴增能力差異性變化來實現建庫與篩選這兩個步驟的自動連接和迭代循環,從而減少人力勞動,使定向進化快速進行[2]。2011年,美國哈佛大學David Liu實驗室開發了噬菌體輔助連續進化(Phage-Assisted Continuous Evolution, PACE)[3],將M13噬菌體的增殖與待進化的生物分子功能關聯在一起,在一天就實現了數十輪的定向進化,大大提升了進化效率,是定向進化技術發展中里程碑式的重要突破。PACE已被應用于RNA聚合酶、TALEN、Cas9、堿基編輯器等重要酶類的進化[3-6]。 

                然而,如果我們要同時進化多個目標蛋白,目前還缺少一種簡便的定向進化技術/方法;另一方面,PACE系統需要連續培養裝置(恒化器,chemostat)、復雜的流速控制與檢測設備和一定的操作技巧,因此普通實驗室不太容易開展PACE實驗。新發展的SPACE系統將復雜的進化裝置簡化成一個每個生物實驗室都有的瓊脂平板,很好的解決了這兩個難題。 

                  

                定量解析宿主-病毒共遷移系統的進化時空動力學 

                SPACE系統的開發靈感來源于劉陳立課題組前期關于細菌遷移定植的研究(詳見:專家點評Nature | 劉陳立/華泰立合作利用遷徙進化實驗揭示合成生物建構原理[7]。在前期研究中,團隊發現處在空間擴張前鋒(front)的細菌始終保持在對數生長期,而落后于前鋒的細菌不再進行定向遷移運動并繼續生長進入平臺期。這不就是一個“移動的恒化器”嗎(圖1A)? 

                  

                

                1 細菌空間擴展過程中的噬菌體感染 

                A,細菌空間擴展系統連續培養裝置的相似性;B,細菌-噬菌體遷移實驗示意圖;C,實驗結果 

                  

                本項目研究團隊原創性地利用這個“移動的恒化器”替代PACE系統中噬菌體的持續擴增所需要的連續培養裝置,從而大幅簡化了系統。研究團隊構建了細菌-噬菌體共遷移實驗體系,使得原本沒有運動能力的噬菌體被處于空間擴張運動過程中的宿主細菌攜帶并廣泛傳播。由于被感染的細菌生長速率慢于未被感染的細菌,最終軟瓊脂表面的菌苔上產生肉眼可見的低細菌密度的扇形感染區(圖1BC)。雖然宿主-病毒共遷移系統在自然界普遍存在,但人們對遷移過程中病毒如何進化了解的很少。 

                為了理解這一過程,劉陳立課題組與傅雄飛課題組合作,以經典的傳染病模型SIR(易感者Susceptible,感染者Infected,康復者Recovered)為基礎,結合細菌空間擴張運動模型,建立了空間擴張系統的宿主感染模型(Range Expansion with Susceptible Infected Recovered kinetics)(2)。該數學模型刻畫了空間擴張體系下細菌-噬菌體共遷移的時空動力學,解釋了扇形噬菌體感染區的形成過程(1C)。結合模型模擬與定量實驗,研究團隊發現扇形感染區的面積與噬菌體感染并產生子代的能力呈正相關關系,這使噬菌體感染能力的強弱有了直觀的可視化表征方式。 

                  

                

                2 空間擴展過程中噬菌體與細菌互作動力學模型 

                A,細菌SIR三種狀態的轉化及噬菌體生產的數學描述;B,感染動態不同位置方向上的差異性;C,模型模擬噬菌體感染區的形成動態;D,模型模擬強弱噬菌體初始比例PS:PW=1:105 空間競爭 

                  

                隨后,研究團隊利用理論模型結合實驗進化的方式,解析細菌遷移過程中噬菌體感染宿主的進化動力學。對于宿主而言,它們的進化主要發生在擴展運動的前鋒中,這種現象被稱為空間分選進化(spatial sorting)[8]。研究團隊一開始認為病毒的進化也主要發生在同樣的位置。然而,后續研究中團隊觀察到了與該預期截然不同的結果:與更高的感染能力相關的噬菌體有益突變快速積累的位置并不是在宿主運動的前鋒中,而是沿著扇形感染區域的側邊沿。該現象產生的原因與側邊沿處存在的非平衡的感染狀態有關。這一發現可能也適用于其它生態系統的宿主/病毒共遷徙現象。 

                  

                理性設計構建空間連續定向進化系統 

                基于上述定量理解,團隊設計構建了SPACE系統(圖3)。為了適應SPACE在半固體培養基中的應用,對宿主菌攜帶的一個關鍵誘變質粒進行了功能改造,使具有誘變效果的基因只在宿主細菌被噬菌體感染之后表達。未進化的初始噬菌體感染能力很弱,幾乎不能在宿主細菌的空間擴展過程中形成可見的扇形感染區。如果誘變過程中其攜帶的待進化基因產生了有益突變,則可以產生感染能力增強的子代噬菌體,從而使其感染區域面積顯著擴大。 

                  

                  

                3 SPACE系統的構建  

                A, 利用噬菌體休克蛋白(phage shock protein, psp)啟動子改造誘變模塊;B, psp啟動子僅在存在噬菌體感染的條件下啟動表達;C,SPACE系統基因線路設計;D,T7 RNA聚合酶進化前后識別目標啟動子活性變化 

                  

                SPACE實現大規模平行定向進化 

                SPACE系統具有可視化、簡便的優勢,可以實現大規模平行進化實驗。研究團隊利用該系統平行進化了T7 RNA聚合酶識別隨機啟動子序列的能力(圖4),獲得了一系列啟動子變體-RNA聚合酶突變庫,可用于進一步改造及工程應用。 

               

                 

                4 利用SPACE進行大量平行進化 

                A,平行進化T7 RNA聚合酶對人工啟動子庫識別活性的實驗示意圖;B,進化獲得的能夠識別目標啟動子的聚合酶突變體 

                  

                本項工作著眼于合成生物學研究中可用元件匱乏這一亟待解決的關鍵問題,在現有連續定向進化方法的基礎上,通過實驗與模型模擬相結合的方式定量研究了宿主細菌的空間遷移運動對其噬菌體進化的作用規律,并由此利用空間維度發展了蛋白質等生物分子的連續定向進化方法,示范了定量合成生物學的研究范式。SPACE系統可以在普通實驗室中實現生物元件的大規模平行進化改造,為合成生物學在化工、醫療等領域的應用提供豐富的元件庫。同時,細菌空間遷移運動對噬菌體進化的作用規律,也將對于研究更高等的生物如昆蟲、鳥類的遷徙對其攜帶的可能對人類健康也存在影響的病毒如何進化等生態學理論或調查研究提供參考和示范。 

                該項工作獲得了中科院先導專項B、科技部重點研發計劃、國家自然科學基金、中科院交叉學科創新團隊等項目支持。 

                  

                  

                [1] Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: Pathways of adaptive protein evolution [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(supplement_1): 9995-10000. 

                [2] Badran AH, Liu DR. In vivo continuous directed evolution [J]. Curr Opin Chem Biol, 2015, 24(1-10. 

                [3] Esvelt KM, Carlson JC, Liu DR. A system for the continuous directed evolution of biomolecules [J]. Nature, 2011, 472(7344): 499-503. 

                [4] Hubbard BP, Badran AH, Zuris JA, Guilinger JP, Davis KM, Chen L, Tsai SQ, Sander JD, Joung JK, Liu DR. Continuous directed evolution of DNA-binding proteins to improve TALEN specificity [J]. Nat Methods, 2015, 12(10): 939-942. 

                [5] Miller SM, Wang T, Randolph PB, Arbab M, Shen MW, Huang TP, Matuszek Z, Newby GA, Rees HA, Liu DR. Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs [J]. Nat Biotechnol, 2020, 38(4): 471-481. 

                [6] Thuronyi BW, Koblan LW, Levy JM, Yeh WH, Zheng C, Newby GA, Wilson C, Bhaumik M, Shubina-Oleinik O, Holt JR, Liu DR. Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity [J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(9): 1070-1079.  

                [7] Liu W, Cremer J, Li D, Hwa T, Liu C. An evolutionarily stable strategy to colonize spatially extended habitats [J]. Nature, 2019, 575(7784): 664-668. 

                [8] Shine R, Brown GP, Phillips BL. An evolutionary process that assembles phenotypes through space rather than through time [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(14): 5708-5711. 

                  

                  


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